Sangerova činidlo sa používa na určenie sekvencie aminokyselín , ktoré tvoria peptid . Činidlo zapadne na – alebo tag – aminokyselinu na samom konci peptidového reťazca , tiež známy ako N – konci . Peptid potom môže byť rozdelená do kusov ( hydrolyzuje ) a jednotlivé aminokyseliny skúmať pomocou rôznych metód chromatografie . Bez ohľadu na aminokyselina nesie značka je jedným koncom . Sangerova činidlo je tiež známy ako dinitrofluorobenzene ( DNFB ) . Akonáhle je naklonený na aminokyseliny , to je odvolával sa na ako DNP – compound.Things budete potrebovať klipart laboratórnom rozsahu
Rukavice
Ochranné okuliare
odstredivka
Centrifugujte
Pasteur pipety
destilovaná voda
4,2 % roztokom hydrogénuhličitanu sodného
Sanger činidlo ( FDNB )
pH papiera
dietyléteru
6M roztoku kyseliny chlorovodíkovej
acetónu
test trubice
Zobraziť ďalšie inštrukcie Cestuj 1
odvážte 3 miligramov peptidu na stupnici . Umiestnite ju do centrifugačnej skúmavky . Pridá sa približne 0,3 ml vody , 0,3 ml činidla Sanger a 0,075 ml hydrogénuhličitanu sodného .
2.
Nechajte centrifugačnej skúmavky inkubovať pri izbovej teplote po dobu jednej hodiny . Počas inkubácie , pretrepe trubice opatrne , aby sa zabránilo zmesi z oddelenia . Skontrolujte pH roztoku každých 15 minút s pH papiera . Hodnota pH by mala byť vyššia ako 9. Ak začne klesať , pridá sa malé množstvo hydrogénuhličitanu sodného ( približne jedna kvapka s Pasteurovou pipetou ) .
3
Po inkubácii sa pridá 1,5 ml vody a rovnaké množstvo éteru . Roztok sa rozdelí na vrstvy . Možno sa budete musieť odstrediť zmesi ju oddeliť . Odstráňte Éterická vrstva ( vrchná , žltá vrstva ) sa pipetou a vyhoďte ju .
4
Upravte pH až 1,0 pomalým pridaním kyseliny chlorovodíkovej . Pridajte trochu kyseliny v čase , jemne premiešajte , potom skontrolujte pH pomocou pH papierika . Celkom by vyžadovať asi 0,15 ml kyseliny . Ak pH klesne pod 1,0 , pridá sa malé množstvo ( nie viac ako kvapka ) hydrogénuhličitanu sodného .
5
Pridajú sa 3 ml éteru . Nechajte zmes oddeliť . Teraz vrchná vrstva ( žltá , éter vrstva ) obsahuje vaše DNP – zlúčeniny . Pomocou pipety , starostlivo extrahovať túto vrstvu a prenášať ich do čistej skúmavky . Umiestnite skúmavku stranou a nechajte kvapaliny vyparovať sa , zanechala za sebou suché , žltá pevná látka .
6
umyte pevná s acetónom . Pridať 0,3 mililiters acetónu , jemne premiešajte a extrahovať kvapalinu s pipetou . Pridajte 0,75 mililiters kyseliny do skúmavky . Váš peptid je teraz označený a pripravený k hydrolyzuje a analyzované metódou chromatografie podľa vášho výberu .