Potenciál vodíka , alebo pH , je miera kyslosti alebo zásaditosti kvapaliny . Je dôležité v mnohých oblastiach , vrátane biológie , chémie a vedy o životnom prostredí . Meranie pH je jednoduché , vo väčšine situácií . Lakmusový papierik môže byť vložená do kvapaliny , a zmena farby papiera predstavuje mieru, v ktorej je tekutina kyseliny alebo bázy . V prípadoch , kedy je tekutina , ktoré sa skúšajú je vo vnútri bunky , iné metódy majú byť devised.Things budete potrebovať celým 2 ‚ , 7‘ – bis – ( 2 = karboxyethyl ) -5 ( a -6 ) – karboxyfluorescein ( BCECF ) , alebo iné látky , ktorá má rôzne fluorescenciu za rôznych podmienok pH
fluorescenčný spektrofotometer s dvojitým monochromátorov , alebo podobný nástroj na meranie fluorescencie
Odstredivka
vopred stanovenej kalibračnej krivky merania korelácie intracelulárnu BCECF a cytoplazmatickej pH
Zobraziť ďalšie inštrukcie
1
ochladiť teplotu vzorky buniek na 41 až 50 stupňov Celzia . To umožňuje lepšiu absorpcie fluorescenčného materiálu buniek .
2
Vložte vzorku buniek s fluorescenčným vyvolávajúce látky , ako BCECF . To sa vykonáva pridaním BCECF k bunkovej médium , potom za stáleho miešania sa zmes opatrne po dobu 2,5 hodiny . BCECF sa vstrebáva cez priepustnú membránu buniek .
3
Oddeľte buniek z média a akejkoľvek neabsorbovaného BCECF spustením vzorky pomocou odstredivky . Vložiť bunky do inej nádoby .
4
zahrieva vzorku buniek na 98,6 stupňov Celzia po dobu 30 minút , sa zbližujú podmienky v ľudskom tele . Ak sú bunky skúmané normálne žijú v nejakom inom prostredí , než je ľudské telo , upraviť vzorka na vhodnú teplotu .
5
rozrušiť vzorku buniek miešaním . To prispieva k zvýšeniu fluorescenčné aktivitu .
6
Zmerajte intenzitu fluorescencie vzorky buniek pomocou spektrofotometra . Pre dosiahnutie najlepších výsledkov , použite excitačné svetlo na vlnovej dĺžke 500-510 nanometrov . Na týchto vlnových dĺžkach , je väčšie rozšírenie intenzity fluorescencie , takže je ľahšie odlíšenie výsledkov . Intenzita fluorescencie sa meria v relatívnych fluorescenčných jednotiek ( RFU ) , pomer jasu látky v vzrušenom , fluorescenčné stavu do normálneho , unexcited stavu . Čím vyššia RFU , jasnejšie látka , v porovnaní s normálnym stavu .
7
Porovnanie výsledkov spektrofotometra pre- ťahané kalibračnej krivky . Všeobecne platí , že vyššia fluorescenčné , tým vyššiu hodnotu pH vo vzorke . S excitačnej vlnovej dĺžke 510 nm , substancie s pH 6,4 sa ukazujú RFU asi 20 , zatiaľ čo látka s pH 9,9 sa ukazujú RFU asi 55.
< Br >