in vitro experimenty sú vykonávané mimo živý organizmus v skúmavke alebo podobnom prostredí . Vedci môžu RNA kópie alebo prepisy génu in vitro prostredníctvom procesu nazývaného v transkripcii in vitro . Enzým , ktorý je RNA transkript na základe génu sa nazýva RNA polymeráza . Jedna taká molekula je SP6 polymerázy . To si vyžaduje úsek DNA sa nazýva SP6 promótor , aby správne fungoval . Predkladatelia
promótor je oblasť DNA viazaná RNA polymerázou pre zahájenie transkripcie . SP6 polymerázy vyžaduje veľmi špecifická sekvencia je prítomná v promótorom zaväzujúce, takže keď je SP6 polymeráza používa pre in vitro transkripciu , musí byť gén obsahovať SP6 promótor , aby došlo k transkripcii . SP6 polymeráza je z typu vírusu s názvom bakteriofága ; biotechnologické spoločnosti vyrábať túto polymerázu tým , že nakazí baktérie Salmonella sa fágov a následne izoluje polymerázu .
Expression
bazálnej expresie a aktivita sa vzťahuje k úrovni expresie v neprítomnosti iné molekuly , ktoré zvýšia alebo znížia na úroveň transkripcie . Aktivátory alebo represor , napríklad, sú proteíny , ktoré sa viažu k promótorom alebo iných regulačných oblastí génov a buď pomáhajú pri nábore RNA polymerázy , alebo zabrániť tomu , aby z väzby . Induktory sú molekuly , ktoré zvyšujú produkciu génového produktu zvyšovanie úrovne expresie .
SP6
Bazálna činnosť pre SP6 promótor sa bude líšiť v závislosti od podmienok Váš experiment . Najdôležitejšie úvahy , samozrejme , je to , ako experimentálnych podmienok môže mať vplyv na aktivitu a ako SP6 porovnaní s inými systémami . Všeobecne možno povedať , SP6 polymerázy a promotéri dodať nižšia účinnosť ako in vitro transkripčných systémov T7 alebo T3 , aj keď za ideálnych podmienok SP6 je zhruba porovnateľný s týmito dvoma . Rovnako ako SP6 , ako T7 a T3 použiť RNA polymerázy z bakteriofága .
Podmienky
Salt koncentrácie a teploty sú dva dôležité faktory pri určovaní bazálnu aktivitu . SP6 je veľmi citlivý na koncentráciu soli , takže vyššia koncentrácia soli môže znížiť svoju činnosť výrazne . Všetko ostatné zostáva rovnaké , výraz je významne vyššia u 104 stupňov Fahrenheita , než na 99 stupňov Celzia . Koncentrácia nukleotidov je ďalším dôležitým aspektom . Nízke koncentrácie môžu potenciálne spôsobiť prepis ukončiť predčasne , a tým znížiť účinnosť . Zvýšenie koncentrácie nukleotidov sa tomuto problému vyhnúť . Ak ste syntetizovať RNA sond , ale s tým , príliš veľa neznačkovanej nukleotid zníži množstvo značeného nukleotidu v konečnom produkte .