patch – clamp experiment sa používa na meranie jednotlivé živých buniek . Robí to s veľmi jemnou pipetou úzko konala proti membráne v jedinej bunky ( vonkajší ochranný krycí ) . Otvorenie tohto pipety je iba asi 1 mikrón ( tisícina milimetra ) a je riadený opticky pod mikroskopom . Bunky sú uchovávané v jednotnej miske pomocou mobilného detacher , ako je trypsín . Špecifická bunka je vybraná a pipety tip je umiestnený na bunkovej membráne . Utesnenie je tvorený pomocou sania a časť membrány je vypracovaný do pipette.Things budete potrebovať klipart mobilné dosku
fosfátový pufer alebo PBS ( bez vápnika a horčíka )
Trypsín
inkubátor
10 mililitrov pipeta
HEK ( ľudský epidermálny keratinocyctes ) strednej
plodové teľacie sérum ( FCS )
odstredivka
externé riešenie pre nahrávanie
Patch clamp čip
Twist čiapky
elektród
Zobraziť ďalšie inštrukcie Cestuj 1
získať tanier pre bunky . Dvakrát s 10 ml PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok ) bez vápnika a horčíka dosku umyť . Pridajú sa 2 ml detacher ( trypsín ) . Inkubujte doštičku po dobu troch minút pri teplote 37 stupňov Celzia . Platňa sa pozoruje pod mikroskopom , aby sa zabezpečilo , že bunky boli oddelené . Jemne presunúť dosku odpojiť všetky bunky zo spodnej časti dosky . Pridá sa 10 ml HEK ( ľudskej epidermálnej keratinocyctes ) a FCS ( fetálne hovädzie sérum ) médiá . Pomocou 10 ml pipety pre pohyb bunky hore a dole .
2
Dodržujte bunky pod mikroskopom , aby sa zabezpečilo , že sú jednotlivé bunky . Pipetou pridá pomocou 10 – ml pipety , kým sa bunky sú jediné , v prípade potreby . Odstredivka bunky po dobu dvoch minút pri 1000 otáčkach za minútu . Odstráňte supernatant . Umiestnite buniek v 10 ml fetálneho teľacieho séra . Odstredivka bunky opäť po dobu dvoch minút pri 1000 otáčkach za minútu . Odstráňte supernatant . Umiestnite bunky v 200 ul externé riešenie pre nahrávanie . Dodržujte bunky pod mikroskopom pre jednotlivé bunky s hladkou membránou .
3
umiestnite soľný roztok vnútri patch clamp čipu . Pridajte kvapku intracelulárneho roztoku elektrolytu na spodnej časti čipu pomocou pipety . Namontujte čip na twist uzáverom . Twist uzáver by mal obsahovať referenčné elektródu a sacie potrubie . Pridajte kvapku extracelulárneho roztoku elektrolytu k hornej časti čipu pomocou pipety . Roztok elektrolytu umožňuje čipu , aby sa kontaktu s elektródou . Pridá sa 5 mikrolitrov bunkovej suspenzie do soľného roztoku v čipe . Umiestnite jednu bunku pomocou sania pomocou pipety . Sanie môže byť vykonané ručne nasávanie vzduchu cez pipety . Umiestnenie odpor zvyšuje buniek pre vytvorenie tesnenia . Tesnenie umožňuje vyšetrovanie celej bunky .