TOPO klonovanie je proces klonovania , ktorá využíva všeobecne, 3 ‚ zvyšky , ktoré sú termodynamicky nestabilné a kombinuje ich s polymerázy Taq DNA . Okrem toho , proces používa nový produkt , polymerázová reťazová reakcia ( PCR ) , ktoré sa musí skladovať pri teplote 4 ° C. Táto forma klonovanie optimalizuje aktívny topoizomerázy I molekuly pridané do konca lineárneho vektora . Ak chcete vykonať TOPO klonovanie , treba dodržiavať určité protokolu . Príprava
možno užívať niektoré základné kroky pre urýchlenie celkového TOPO klonovacia proces a pomôže zaistiť jeho úspech . Po prvé , rúrky životaschopných buniek by mali byť umiestnené na ľad k udržaniu ich prijateľnosť . Ďalšie , super optimálna kultúra ( SOC ) stredný , bakteriálny rast obohatené živinami , by mala byť uvedená na izbovú teplotu . Selektívna dosky by potom mali byť predhriatej na 37 stupňov Celzia , takže sú plne pripravení , až príde čas na ich použitie .
Kombinácia Zloženie
Ak chcete začať klonovanie spôsob , kombinácia 2 mikrolitrov polymerázovej reťazovej reakcie ( PCR ) produktu , 0,5 ul soľného roztoku a 0,5 mikrolitrov klonovacieho vektora by mala byť kombinované v 0,5 mililitrové centrifugačnej skúmavky . Potom, čo v kombinácii , bude treba nastaviť na teplotu miestnosti a nechá sa inkubovať päť – desetminut tieto zložky . Ďalej sa kombinované zložky pridaný do “ Top – 10 chemicky kompetentných buniek “ v 50 – microliter skúmavky a umiestni na ľad po dobu ďalších desiatich minút . Potom sa bunky musia byť tepelne šoku pri teplote 42 stupňov Celzia a presne umiestni na ľad po dobu ďalšiu minútu , než sa pridá 180 ul SOC média . Táto zmes sa potom trepe v horizontálnom smere pri 200 otáčkach za minútu po dobu ďalšej hodiny pri teplote 37 stupňov Celzia .
Záverečné kroky
Zmes 50 ul a 100 ul každej reakcie by mali byť nanesené “ na LB + AMP + X – Gal dosiek a inkubuje bez trepania cez noc pri 37 ° C. “ Ďalší deň tri biele kolónie z každej reakcie by mala byť vybral a umiestnené v 4 ml LB + AMP a ponechané inkubovať cez noc pri teplote 37 stupňov Celzia , pričom je pretrepáva pri 200 otáčkach za minútu . Posledným krokom je mini – príprava plazmidov a čakajú , či tento proces bol úspešný .